芜菁Br14-3-3的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆了‘津田芜菁’（Brassica rapa subsp. rapifera‘Tsuda’）通用调节因子14-3-3基因cDNA序列，命名为Br14-3-3（GenBank登录号为MK896872）。该基因全长1 113 bp，开放阅读框全长774 bp，编码含有257个氨基酸的多肽。荧光定量PCR分析Br14-3-3在‘津田芜菁’不同组织中及其在温度、脱水、渗透、ABA和无机盐等非生物胁迫下幼苗中的表达，结果表明该基因在‘津田芜菁’的花中表达量最高，幼苗中次之；低温抑制了Br14-3-3的表达，其他非生物胁迫可诱导该基因表达，暗示Br14-3-3在非生物胁迫应答中发挥功能。     

枸杞Lb_PPR1的克隆及其在不同育性品种中的表达分析

三角状五肽重复（Pentatricopeptide repeats，PPR）蛋白定位于多种细胞器中，参与细胞核和细胞器中特异单链RNA的转录后修饰和编辑，在植物生长发育的多个阶段均发挥着重要的作用。分别从枸杞（Lycium barbarum）雄性可育系‘宁杞1号’和不育系‘宁杞5号’中克隆了Lb_PPR1基因，并对其编码蛋白质进行理化性质、亚细胞定位、保守结构域、蛋白结构以及系统进化等方面进行预测分析。结果显示，‘宁杞1号’和‘宁杞5号’中Lb_PPR1基因的开放阅读框均为1 977 bp，编码658个氨基酸，但其中存在20个碱基和14个氨基酸的差异。Lb_PPR1蛋白包含14个串联重复的PPR保守基序，属于PLS家族，该蛋白定位在细胞膜和细胞质。二级、三级结构预测显示该蛋白以α螺旋为主。同源进化分析得出Lb_PPR1蛋白与同属茄科的辣椒和烟草PPR蛋白亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR检测Lb_PPR1在枸杞不同组织器官及不同发育阶段花药中的表达特性。结果显示，Lb_PPR1在枸杞不同组织中均有表达，但在可育系花蕾中表达量最高，不育系‘宁杞5号’各组织中表达量均显著低于可育系‘宁杞1号’。以上结果表明，Lb_PPR1基因可能与枸杞花药发育有关。     

NaCl胁迫对甜瓜生理指标及相关基因表达的影响

以薄皮甜瓜(IVF05、IVF89)和厚皮甜瓜(IVF117、IVF303)为试材,研究Na Cl(150 mmol·L~(-1))处理对4个甜瓜品种发芽、幼苗生长及相关基因表达的影响。结果表明,在Na Cl胁迫下,薄皮甜瓜IVF89的生长指标受到的抑制作用最大,其发芽率、发芽指数、胚根长度和胚轴长度分别下降23百分点、76.24%、46.71%和39.27%;厚皮甜瓜IVF303的生长指标受到的抑制作用最小,其发芽率下降不明显,发芽指数、胚根长度和胚轴长度分别下降46.52%、34.86%和23.08%;Na Cl胁迫提高了甜瓜幼苗叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,增加了游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白的含量;4个甜瓜品种幼苗的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和SPAD值均显著降低,IVF05、IVF89、IVF117和IVF303的Pn分别下降了64.44%、69.62%、61.23%、60.00%;4个甜瓜品种的卡尔文循环(Calvin)关键酶基因1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因(CmRubisco)、3-磷酸甘油酸激酶基因(CmPGK)和叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶基因(Cm FBPase)表达均显著下调,核酮糖-5-磷酸激酶基因(Cm PRK)表达大多上调;甜瓜耐盐相关基因质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(Cm SOS1)、液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(CmNHX1)、高亲和力K~+转运体基因(CmHKT1)和N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因(CmGnT)的表达均上调,其中IVF303的基因表达上调幅度最大。通过主成分分析、相关分析和聚类分析等综合分析方法,将4个甜瓜品种分为3类,IVF05和IVF89为盐敏感类型,IVF117为中耐盐类型,IVF303为强耐盐类型。     

不同丝瓜品种褐变相关基因的表达分析

以7种不同丝瓜品种为试验材料,对采后丝瓜果实进行褐变鉴定,测定多酚氧化酶(PPO)活性、过氧化物酶(POD)活性及相关基因的表达量。结果表明:"苏丝3号""苏丝6号""苏丝7号"属于抗褐变品种;"苏丝4号""苏丝5号""苏丝10号"属于耐褐变品种;"苏丝8号"属于严重褐变。从褐变酶POD和PPO变化来看,"苏丝8号"POD活性高达456.7 U·mg-1,抗褐变品种"苏丝3号""苏丝6号""苏丝7号"POD活性均在250 U·mg-1。"苏丝8号"PPO活性为68.2 U·mg-1,"苏丝3号"PPO活性最小,低至25.2 U·mg-1。从褐变基因的变化来看,"苏丝8号"在LcPOD家族基因表达中均高于对照"苏丝3号",其中LcPOD3基因表达量高达5.23,是对照的5倍以上,其它的丝瓜品种LcPOD3基因变化不显著。褐变品种"苏丝8号"在LcPPO基因家族中上调显著,表明"苏丝8号"果实褐变时促进LcPPO基因家族的表达,从而转录翻译成PPO加快果实的褐变。与对照相比,丝瓜褐变基因LCWRKY在"苏丝8号"中上调显著,表明其参与了丝瓜果实采后褐变。其它丝瓜品种LCWRKY上调不显著。     

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。     

Effect of substitution of dietary fish meal by soybean meal on different sizes of gibel carp (Carassius auratus gibelio): digestive enzyme gene expressions and activities,and intestinal and hepatic histology

A 7‐week growth trial was conducted to evaluate the effects of dietary soybean meal (SBM) on digestive enzyme activity of intestinal mucosa, mRNA levels of digestive enzymes in hepatopancreas, and the mid‐intestinal and hepatopancreas histology of gibel carp CAS III (Carassius auratus gibelio). Four different growth phases of gibel carp (initial body weight: fry, 0.8 g; juvenile, 5.0 g; 1‐year‐old, 62.7 g; and broodstock, 135.6 g) were tested. Seven isonitrogenous and iso‐energetic diets were formulated to contain different SBM replacement levels (0%, 20%, 40%, 60%, 80% and 100% of dietary fish meal protein), and another diet (SBMAA) contained all SBM protein and supplied crystalline amino acids. The results showed that the activities of mid‐intestine trypsin, α‐amylase and gamma glutamyl transpeptidase reduced with increased dietary SBM, while the chymotrypsin activity increased first and then decreased. The ultrastructures of intestinal epithelial cells and hepatopancreas cells in fry and broodstock fish were distinctly affected by 200 g kg^‐1 dietary SBM. Supplementation of dietary amino acid to the highest replacement groups was not sufficient to improve digestive and absorptive capacities and growth performance. Gibel carp may be adapted to dietary SBM through increase in gene expression of hepatopancreas digestive enzymes and has potential to utilize proceeded SBM as feedstuffs.     

茶树GGPS基因家族的克隆、生物信息学和表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)是萜类合成途径的结构酶,对植物生长发育具有重要意义。本研究通过RACE和RT-PCR方法克隆得到5条潜在的茶树GGPS序列,分别命名为CsGGPS1-4和CsGGPS9,其中CsGGPS9存在3条等位基因,分别是CsGGPS9-1、CsGGPS9-2和CsGGPS9-3,在系统进化树上与其他基因分成两支。蛋白质序列分析表明,茶树GGPS家族成员都具有polyprenyl_synt结构域,不存在信号肽序列。亚细胞定位预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4定位在叶绿体上,CsGGPS3和CsGGPS9定位在线粒体上。通过Swiss Model进行三维建模,结合"three-floor"模型对茶树GGPS家族成员的功能进行预测,预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4是GGPS;CsGGPS3是异源二聚体形式的牻牛儿基焦磷酸合酶的小亚基;CsGGPS9的催化主产物是碳链数大于30的异戊烯基焦磷酸。q RT-PCR分析表明,CsGGPS1整体表达丰度较低,仅在一芽二叶中表达量稍高;CsGGPS2在茶树各个组织中均有表达,在花中表达量最高,且花发育过程中表达量先上升后下降;CsGGPS3在叶和幼根中的表达量高于花,花发育过程中表达平稳;CsGGPS4在茶树各个组织中表达量数值相近,在花发育过程中表达量变化趋势与CsGGPS2相同;CsGGPS9的表达量在成熟叶中显著低于幼嫩叶片。     

斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析

研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(Pm Chi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因c DNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因c DNA全长2 050 bp,其中5'-非编码区(5'-UTR)144 bp、3'-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。